01.導讀PCR是1984年開始出現(xiàn)的一項基因檢測技術(shù)，由于PCR技術(shù)具有簡便易行、敏感度高等優(yōu)點，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床檢測，成為分子生物學必要的研究工具。傳統(tǒng)的PCR定量是應(yīng)用終點PCR來對樣品中的模板量進行定量，通常用凝膠電泳分離，并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的終擴增產(chǎn)物。但在PCR反應(yīng)中，由于反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等因素會影響PCR反應(yīng)效率,甚至出現(xiàn)一些非特異性擴增產(chǎn)物。因此，用終點PCR法來定量并不準確。

　　實時熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qPCR)是1996年由美國AppliedBiosystems公司推出的一種新的定量技術(shù)，該技術(shù)克服了PCR法進入平臺期后定量的較大誤差問題,實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量，而且具有敏感度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術(shù)在醫(yī)學臨床檢驗及臨床醫(yī)學研究方面都有著重要的意義。

　　02.基本原理：在PCR反應(yīng)過程中，每經(jīng)過一個循環(huán),PCR產(chǎn)物量增加.相應(yīng)的熒光信號強度也跟著增加,此時收集一個熒光強度信號。經(jīng)過若干個循環(huán)后，可以得到一條以循環(huán)數(shù)(cyclethreshold,CT)為橫坐標和熒光強度(△Rn)變化為縱坐標的“S"形熒光擴增曲線。

　　我們將這條熒光擴增曲線人為地分為背景期、指數(shù)擴增期和平臺期三個階段:

　　①背景期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所覆蓋，我們無法判斷熒光強度的變化。

　?、谥笖?shù)擴增期，熒光信號呈指數(shù)增長，擴增產(chǎn)物的量與起始模板量存在線性關(guān)系，在此階段可定量分析。

　　③平臺期，由于底物耗盡等因素.熒光信號不再呈指數(shù)增加。

　　重要的概念：實時熒光定量PCR技術(shù)中有幾個重要的概念，包括擴增曲線、基線、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù)。圖片。

　?。?）擴增曲線（amplificationcurve）:是在實時熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進行PCR反應(yīng)過程中，通過檢測系統(tǒng)對PCR管內(nèi)的樣品進行實時檢測，將熒光信號值通過成像技術(shù)顯現(xiàn)在計算機上。正常的擴增曲線包括四個階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺期。

　　（2）基線（baseline）：是背景曲線的一段，在擴增反應(yīng)的初數(shù)個循環(huán)里熒光信號變化不大，接近一條直線。

　?。?）熒光閾值（threshold）:是在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個熒光強度標準(即PCR擴增產(chǎn)物量的標準）。熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期。

　?。?）閾值循環(huán)數(shù):表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標,CT值為縱坐標的一條標準曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標準曲線上計算出該模板的起始拷貝數(shù)。

　　03.反應(yīng)體系

　　反應(yīng)體系和條件

　?。?）模板濃度與純度:模板的初始濃度越低，結(jié)果的重復性越差。初始濃度越高，超出了反應(yīng)體系的線性范圍，則需要對模板進行稀釋，否則隨著底物的過早耗盡，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果待測模板的濃度處于PCR反應(yīng)體系的檢出限附近.則需要檢測雙份以保證結(jié)果的可靠性

　?。?）酶及其濃度:TaqDNA聚合酶有兩種，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶：另一種是從大腸埃希菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)需要2.5U的酶。濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

　　（3）Mg2+的濃度:Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)物有顯著影響。Mg2+的濃度過高，會增加引物二聚體的形成；Mg2+的濃度過低，會降低TaqDNA聚合酶的活性。